共聚焦顯微鏡中的圖像是來自一個焦平面的光通過針孔數(shù)碼相機聚焦拍攝，從而規(guī)避 來自其支點上方或下方的光。固定在設備上的激光連續(xù)聚焦在樣品的選定區(qū)域，同時，被樣品吸附的熒光染料也會被數(shù)碼相機捕捉。共聚焦設備包含兩個旋轉(zhuǎn)鏡頭用來拍攝組圖。

然后通過所累積的不同焦平面的圖像序列，使用軟件編譯完整的 3d 圖像。此圖像可以在軸向（z 軸）和橫向（x 和 y 軸）平面進行微調(diào)。這些細胞和其他矩陣的再現(xiàn)是通過使用雙倒置的光錐照亮物體來實現(xiàn)的。

使用標準落射熒光顯微鏡所存在的問題是當遇到較厚的基質(zhì)或標本時所表現(xiàn)出的熒光程度較大。大于 2 微米的樣品發(fā)出的輻射會危及生成圖像的準確性，從而損失成像的細節(jié)。而共聚焦顯微鏡則可以通過縮小激發(fā)范圍并使用光學切片來消除背景噪聲。