2006 年底，美國霍華德‐休斯研究所的華裔科學家莊曉薇實驗組開發(fā)出來一種類似于 PALM 的方法，可以用來研究細胞內(nèi)源蛋白的超分辨率定位。他們發(fā)現(xiàn)，不同的波長可以控制化學熒光分子 Cy5 在熒光激發(fā)態(tài)和暗態(tài)之間切換，例如紅色 561nm 的激光可以激活 Cy5 發(fā)射熒光，同時長時間照射可以將 Cy5 分子轉(zhuǎn)換成暗態(tài)不發(fā)光。之后，用綠色的 488nm 激光照射 Cy5 分子時，可以將其從暗態(tài)轉(zhuǎn)換成熒光態(tài)，而此過程的長短依賴于D二個熒光分子 Cy3 與 Cy5 之間的距離。因此，當 Cy3 和 Cy5 交聯(lián)成分子對時，具備了特定的激發(fā)光轉(zhuǎn)換熒光分子發(fā)射波長的特性。將 Cy3 和 Cy5 分子對膠聯(lián)到特異的蛋白質(zhì)抗體上，就可以用抗體來標記細胞的內(nèi)源蛋白。應(yīng)用特定波長的激光來激活探針，然后應(yīng)用另一個波長激光來觀察、精確定位以及漂白熒光分子，此過程循環(huán)上百次后就可以得到*后的內(nèi)源蛋白的高分辨率影像，被他們命名為隨機光學重構(gòu)顯微技術(shù) (stochastic optical reconstruction microscopy，STORM)。2007 年，他們進一步改進 STORM 技術(shù)，發(fā)展了不同顏色的變色熒光分子對，可以同時記錄兩種甚至多種蛋白質(zhì)的空間相對定位，從而闡明籠形蛋白 clathrin 形成的內(nèi)吞小泡與細胞骨架蛋白之間的精確空間位置關(guān)系，兩種顏色的分辨率都可以達到 20～30nm。原理如下圖：

STORM 通過一對染料對通過隨機發(fā)光空間定位，實現(xiàn)了 XY 20 nm 分 辨率。

SIM
改變光學的點擴散函數(shù)來突破光學J限的另一個方法是利用飽和結(jié)構(gòu)照明顯微技術(shù)(saturated structure illumination microscopy，SSIM)。早在 1963 年，Lukosz 和 Marchand 就提出了特定模式側(cè)向入射的光線可以用來增強顯微鏡分辨率的理論。2005 年，加州大學舊金山分校的 Gustafsson 博士首先將非線性結(jié)構(gòu)性光學照明部件引入到傳統(tǒng)的顯微鏡上，得到了分辨率達到 50nm 的圖像。SSIM 技術(shù)的原理是將多重相互衍射的光束照射到樣本上，然后從收集到的發(fā)射光模式中提取高分辨率的信息。如圖所示：

SIM 通過結(jié)構(gòu)照明莫爾紋原理實現(xiàn)了任何熒光染料都可以達到 XY 100nm。

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